PCR (forskning) - applikation. Vad är PCR-tekniken?

PCR är ett test som har använts vid diagnos av många sjukdomar. PCR-metoden gör det möjligt att visa den direkta närvaron av bakterier i organismen, och särskilt dess DNA. PCR-testning används bland annat vid diagnosen av Lyme-sjukdomen. Vad är PCR-tekniken? Vad är PCR i realtid?

Innehållsförteckning:

PCR (testning) - vad är PCR-tekniken?
PCR (research) - tillämpning av PCR-metoden
PCR (forskning) - Lyme-sjukdomen
PCR (forskning) - resultat. Kan de vara falska positiva?
PCR (forskning) - resultat. Kan de vara falskt negativa

PCR (polymeraskedjereaktion) är den grundläggande metoden som används i genetiska och molekylära laboratorier. Det utvecklades 1983 av Kara Mullis, som tilldelades Nobelpriset 1993 för det.

Hör vad PCR-tekniken handlar om. Detta är material från lyssnande bra cykel. Poddsändningar med tips.

För att se den här videon, aktivera JavaScript och överväga att uppgradera till en webbläsare som stöder HTML5-video

PCR (testning) - vad är PCR-tekniken?

PCR-testning består av multipel amplifiering (vanligtvis i 30-40 cykler) av ett specifikt DNA-fragment, t.ex. gener som kodar för Borrelia-proteiner, med användning av polymerasenzymet.

Sedan används speciella molekylära färgämnen för att synliggöra det amplifierade DNA-fragmentet. PCR, på grund av amplifieringen av specifika DNA-fragment, är en ultrakänslig metod.

I PCR-metoden amplifieras DNA-fragment med användning av specifika primerpar för en given region av det bakteriella DNA: t. Exempelvis är målregioner i PCR som används vid diagnos av Lyme-sjukdom gener som kodar proteiner, t.ex. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.

Det biologiska materialet från vilket testet kan utföras är:

blod
en del av huden från ett migrerande erytem
cerebrospinalvätska
synovialvätska eller från ledbrosk
urin

PCR (research) - tillämpning av PCR-metoden

Förutom diagnosen av Lyme borrelios med PCR-metoden är det möjligt att detektera specifika DNA-fragment från andra mikroorganismer eller människor. Därför används PCR-metoden också i:

diagnostik och övervakning av virusinfektioner: herpesvirus (herpes, herpes zoster, Epstein-Barr, cytomegalovirus), HIV, hepatitvirus (HBV och HCV)
diagnostik och övervakning av bakterieinfektioner, särskilt de bakterier som inte kan identifieras genom odling, t.ex. tuberkulos
diagnostik och övervakning av neoplastiska sjukdomar: leukemier, bröstcancer, kolorektal cancer, lungcancer
diagnos av cancerbenägenhet: bröst- och äggstockscancer (BRCA1- och BRCA2-gener), kolorektal cancer (APC- och CHEK2-gener)
diagnostik av genetiska sjukdomar: hemokromatos (HFE-gen), talassemi (HBA1- och HBA2-gener), celiaki (HLA-gener)
faderskapstester som upptäcker barnets och faderns DNA-kompatibilitet

Läs också: Lyme-sjukdomstester - hur de ser ut och vad är priset för Lyme-sjukdomstest Western Blot-test och Lyme-sjukdom. Tolkning av testresultaten Tickburna sjukdomar: Lyme-sjukdom, babesios, bartonellos, TBE och andra.

För närvarande finns det många modifieringar av PCR-metoden. Till exempel används vid diagnos av Lyme borrelios metoderna för kapslad PCR och PCR i realtid. Den senare är en kvantitativ metod och gör det möjligt att bestämma det exakta antalet Borrelia-DNA-kopior i det testade biologiska materialet.

PCR (forskning) och Lyme-sjukdomen

Serologiska tester är grunden för diagnosen Lyme-sjukdom. Det finns dock kliniska situationer som kan orsaka att dessa tester är falskt negativa:

serologiskt fönster, dvs den initiala infektionsperioden där kroppen ännu inte producerar specifika IgM- och IgG-antikroppar mot Borrelia spirocheter
hos personer med immunbrist som inte producerar tillräckligt med antikroppar
närvaron av immunkomplex som består av Borrelia-antigener och specifika antikroppar för dem, och förhindrar detektion av antikroppar med serologiska metoder

Om symtomen på Lyme-sjukdomen misstänks hos patienten och de serologiska testresultaten är negativa, kan molekylär testning baserad på PCR-metoden utföras.

DNA från Borrelia spirochetes kan detekteras i början av infektionen, eftersom antalet spirochetes i kroppsvätskor då är det högsta.

Vid diagnosen av Lyme borrelios används serologiska metoder som ELISA främst, men i vissa kliniska situationer är genetiska tester med PCR-metoden användbara.

Ju längre tid från infektion, desto mindre sannolikt är det att detektera bakteriellt DNA. I vissa fall, innan PCR-testet utförs, odlas bakterier på specialmedier i 1-2 veckor och sedan utförs testet.

Detta tillvägagångssätt används vid misstankar om Lyme-sjukdom och skördad cerebrospinalvätska. I den sena infektionsfasen är det mer lämpligt att utföra ett ELISA-test.

PCR-metoden ska inte användas vid den rutinmässiga diagnosen av Lyme borrelios på grund av bristande standardisering avseende förekomsten av Borrelia burgdorferi-sorter i Polen.

I fallet med diagnosproblem (särskilt i det tidiga skedet av sjukdomen) hjälper dock resultatet av PCR-testet i diagnosprocessen.

Ett positivt testresultat innebär att närvaron av Borrelia burgdorferi-DNA och dess sorter upptäcktes i det testade materialet, men det förklarar inte om en aktiv infektion äger rum i kroppen. Å andra sidan utesluter ett negativt resultat inte förekomsten av bakterier i kroppen.

Vissa laboratorier erbjuder test för förekomst av Borrelia DNA i fästingen. Resultatet av en sådan undersökning är dock inte grunden för diagnosen Lyme-sjukdom hos en biten person.

Rekommenderad artikel:

ELISA-test - vad upptäcker det? Hur läser man resultaten? Testets pris

PCR - resultat. Kan de vara falska positiva?

PCR är en ultrakänslig metod och samtidigt mycket känslig för kontaminering. Därför är det mycket viktigt i PCR-baserade tester att välja en lämplig intern kontroll för att utesluta falska positiva effekter.

Nyckeln är också korrekt insamling av material för testning samt erfarenhet och tillförlitlighet hos den diagnostiker som utför testet.

PCR - resultat. Kan de vara falskt negativa

Som i alla laboratorietester, även i PCR-metoden, kan falska negativa resultat visas. Här är det avgörande att samla in blod för ett lämpligt antikoagulant, eftersom vissa av dem, såsom heparin, kan hämma PCR-reaktionen.

Insamling av material efter början av antibiotikabehandling kan också orsaka en minskning av effektiviteten för PCR-reaktionen och en större sannolikhet för falskt negativa resultat.

Man bör också komma ihåg att Borrelia-bakterier lever under mycket kort tid i blodet och kroppsvätskorna, eftersom de tack vare speciella receptorer tränger mycket snabbt in i "svåråtkomliga" platser i kroppen.

Därför, i motsats till diagnostik av andra mikroorganismer, är antalet Borrelia-spiroketer i biologiskt material litet, ibland till och med vid detektionsgränsen för PCR-metoden. Detta kan också orsaka falskt negativt.

Rekommenderad artikel:

Test av lymfocyttransformation (LTT)

Litteratur

Dunaj J. et al. Vikten av PCR-metoden vid diagnos av Lyme borrelios. Bläddra Epidemiol. 2013, 67, 119 - 123.
Laboratoriediagnos av fästingburna sjukdomar. Arbetsgruppens rekommendationer: National Chamber of Laboratory Diagnosticians, National Institute of Public Health-National Institute of Hygiene, National Consultant in the field of infectious sjukdomar, Department of Infectious Diseases and Neuroinfections, Medical University of Białystok, Polish Society of Virology, Warszawa 2014.
Ružić-Sabljić E. och Cerar T. Framsteg i den molekylära diagnosen av Lyme-sjukdomen. Expert Rev Mol Diagn. 2017 jan; 17 (1): 19-30.
Valones M.A.A. et al. Principer och tillämpningar av polymeraskedjereaktion inom medicinska diagnostiska områden: en översyn. Braz J Microbiol. 2009 Jan-Mar; 40 (1): 1-11.

Om författaren

Karolina Karabin, doktor, doktor, molekylärbiolog, laboratoriediagnostiker, Cambridge Diagnostics Polska Utbildad som biolog med inriktning mot mikrobiologi och laboratoriediagnostiker med över 10 års erfarenhet av laboratoriearbete. En examen från skolan för molekylär medicin och medlem av det polska samhället för human genetik. Chef för forskningsbidrag vid laboratoriet för molekylär diagnostik vid institutionen för hematologi, onkologi och inre sjukdomar vid det medicinska universitetet i Warszawa. Hon försvarade titeln doktor i medicinska vetenskaper inom medicinsk biologi vid den första medicinska fakulteten vid Warszawas medicinska universitet. Författare till många vetenskapliga och populärvetenskapliga arbeten inom laboratoriediagnostik, molekylärbiologi och näring. Som specialist på laboratoriediagnostik driver han dagligen den materiella avdelningen vid Cambridge Diagnostics Polska och samarbetar med ett team av dietister på CD Dietary Clinic. Han delar sin praktiska kunskap om diagnostik och dietterapi av sjukdomar med specialister på konferenser, utbildningar och i tidningar och webbplatser. Hon är särskilt intresserad av modern livsstils påverkan på molekylära processer i kroppen.